Dezvoltarea de aplicații ale toxicogenomicii pentru screening-ul și evaluarea riscului în expunerea la contaminanți (arsen, plumb și cadmiu) din factorii de mediu 

ACRONIM: PROMETHEuS (Predicted Risk of Metal Exposure Toxicogenomics Health and Environmental Screening)

Perioada: 23.06.2022-22.06.2024

Nr. instituțiilor implicate: 2 – Centrul de Mediu și Sănătate (CMS) (Coordonator) și Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu (UMF) (Partener)

Valoarea totala a contractului (lei): 1.450.251,00 

Rezumatul proiectului

Metalele toxice precum arsenul (As), cadmiul (Cd) şi plumbul (Pb) sunt larg răspândite în mediul ambiant, gospodării și locuri de muncă, contaminând alimentele și apa potabilă.  Prezentul proiect se bazează pe conceptul de toxicogenomică, care urmărește înțelegerea și predicția datelor de toxicitate folosind datele de transcriptomică (microARN). Obiectivul principal al prezentului proiect îl constituie dezvoltarea unui model toxicologic de predicție pentru a fi utilizat în evaluarea riscului pentru sănătate, o prioritate publică la nivel național și internațional, care urmează să fie exploatat comercial pe piața internă şi internațională. Se urmărește astfel, explorarea, dezvoltarea și exploatarea întregului potențial al toxicogenomicii, în scopul obținerii unui progres în ceea ce privește testele in vitro bazate pe mecanisme ce folosesc celule umane, pentru dezvoltarea unui model toxicologic, precum și pentru identificarea de noi biomarkeri de susceptibilitate în expunerea la metale, spre a fi utilizați în studiile populaționale.

Caracterul inovativ al acestui proiect este dat de modul în care cunoștințele emergente și instrumentele asociate pot fi folosite pentru a îmbunătăți cercetarea în domeniul toxicogenomicii, cu scopul de a o utiliza în evaluarea riscurilor asupra sănătății umane. Integrarea în mod uniform a datelor generate (probe biologice in vitro și de la pacienți) va permite o înțelegere profundă a mecanismelor de interacțiune la nivel celular și molecular a microARN ca și biomarkeri de susceptibilitate în expunerea la metale toxice.

Obiectivul proiectului

Scopul principal al studiului este reprezentat de: elaborarea unui model toxicologic de prognoza pe baza datelor de toxicogenomică, prin determinarea de biomarkeri  de susceptibilitate (miARN și genele țintă ale acestora), spre a fi utilizat în evaluarea riscului asupra sănătății, în cazul expunerii la contaminanți specifici (As, Pb, Cd).

Rezultate estimate: 1) Identificarea de noi biomarkeri de susceptibilitate în expunerea la contaminanți specifici (As, Pb, Cd), spre a fi utilizați în studiile populaționale;
2) Elaborarea unui panel unic de miARN-uri și genele țintă cele mai relevante, validate pentru fiecare contaminant în parte;
3) Elaborarea unui panel comun de screening în expunerea la contaminanții investigați (As, Pb, Cd).

Etapa 1 (2022)

Rezultate

Eșantionare și colectarea probelor biologice – Selecționarea participanților în studiu (femei care au urmat o procedura de fertilizare in vitro (FIV)), precum și colectarea probelor biologice de la acestea, s-a realizat într-un studiu pilot, efectuat anterior acestui proiect. Probele biologice au fost colectate și stocate într-o  biobancă, la -20 ºC și -80 ºC, urmând să fie procesate și analizate în cadrul acestui proiect în vederea determinării biomarkerilor de expunere la metale (As, Pb, Cd) prin tehnica cu plasmă cuplată inductiv cu spectrometrie de masă combinată cu cromatografie lichidă de înaltă performanță (High Performance Liquid Chromatography – Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (HPLC-ICPMS)). S-a elaborat și completat un chestionar de evaluare a expunerii la metale.

Analiza biotoxicologică – De asemenea, au fost elaborate protocoale de analiză biotoxicologică a As, Pb și Cd, precum și designul de studiu toxicologic experimental pe linii celulare, protocolul de analiză a microARN și totodată, echipa partenerului UMF a realizat, procedurile de achiziții pentru consumabile și reactivi de laborator în vederea efectuării studiului experimental pe linii celulare și a analizei microARN (prevăzute a fi efectuate în Etapa 2/2023).

Etapa 2 (2023)

Rezultate

Etapa 2 cuprinde analiza specimenelor biologice, crearea bazelor de date și prelucrarea statistică a rezultatelor analizelor probelor biologice (date de expunere și biomonitorizare), prelucrarea bioinformatică (date de genomică, biomarkeri moleculari) și elaborarea modelului de biodistribuție a metalelor determinate în probele biologice în cadrul analizei complexe de Identificare a unor semnături moleculare specifice pentru integrarea în evaluarea riscului asociat expunerii la arsen, plumb și cadmiu (partea II).

S-au analizat un total de 47 probe urină în care s-a determinat As total și Cd, și 47 de probe de sânge, în care s-a analizat Pb.

În aproximativ 19% din probele analizate, As total determinat în urină a depășit valoarea de referință de 15 µg/l. De asemenea, în aproximativ 15% din probele analizate, Cd determinat în urină a depășit valoarea de referință de 2 µg/l. Concentrațiile de Pb determinate în sânge, s-au încadrat în intervalul de valori normale (sub 10 µg/dl)
Studiul de farmacogenomică a urmărit identificarea unor semnături moleculare specifice, oferind o perspectivă detaliată asupra modului în care aceste metale pot influența expresia genică (folosind tehnologia microarray) și pot contribui la riscuri asociate sănătății umane.
Metodele de analiză bionformatice aplicate în acest studiu au permis explorarea modificărilor subtile la nivel celular, dar și a celor semnificative la nivel transcriptional. S-a identificat un profil molecular alterat ca urmare a expunerii la metalele selectate.

Etapa 3 (2024)                                                                                                           

Rezultate                                                                                                           

Etapa 3 cuprinde validarea semnăturii moleculare și elaborarea modelului conceptual de expunere a consumatorilor.

Modelul conceptual de evaluare a riscului în expunerea la metale include: a) definirea scalei geografice la care se efectuează evaluarea; b) identificarea grupurilor populaționale potențial expuse și a subgrupurilor cu susceptibilitate crescută; c) caracterizarea modalităților și a cailor de expunere; d) descrierea modului în care este evaluată expunerea; e) determinarea modului în care pericolul și răspunsul la doză al receptorului sunt evaluate; f) descrierea modului în care este caracterizat riscul.

Gruparea rezultatelor sub forma de cluster pentru probele de lichid folicular analizate în cazul pacientelor cu infertilitate de cauză idiopatică (IDIO) și respectiv, în cazul celor cu boală inflamatorie pelvină (Pelvic Inflamatory Disease – PID) și sindrom de ovar polichistic (Polychistic Ovary Syndrome – PCOS) versus grupul de control

Evaluarea profilului miRNA folosind tehnica microarray (tehnologia Agilent) în infertilitatea de cauză idiopatică (IDIO) și respectiv, în cazul diagnosticelor de boală inflamatorie pelviană (PID) și sindromul de ovar polichistic (PCOS) oferă o înțelegere mai profundă a mecanismelor moleculare implicate în aceste afecțiuni. Izolarea ARN-ului total s-a realizat din probele de lichid folicular colectate de la pacientele participante în studiu.

Analiza bioinformatică a condus la identificarea a 21 de miRNA diferit exprimate, dintre care 6 supraexprimate si 15 subexprimate, în cazul pacientelor cu PID; 25 de miRNA diferit exprimate, dintre care 16 supraexprimate și 9 subexprimate, în cazul pacientelor cu PCOS; 34 de miRNA diferit exprimate, dintre care 10 spraexprimate si 24 subexprimate, în cazul pacientelor cu infertilitate de cauza idiopatică (IDIO). S-au utilizat soft-uri bioinformatice (Ingenuity Pathway Analysis-IPA) pentru a valida interacțiunile prognozate între miARN-uri și genele țintă, mai exact algoritmi de previziune a țintelor miARN și a analizelor de rețea pentru a confirma și a prioritiza interacțiunile relevante. miARN-urile identificate ca fiind de interes au fost incluse în trei rețele moleculare. Reprezentarea grafică a celei mai relevante rețele moleculare a făcut posibilă stabilirea genelor nodale, a tipului de interacțiune dintre acestea și produșii acestora, de tip direct sau indirect.

Evidențierea miARN-urilor care sunt supraexprimate sau subexprimate în comparație cu grupurile de control, permite identificarea moleculelor cheie implicate în patogeneza afecțiunilor investigate.

REZULTATE (2022-2024)

Prezentare succintă a rezultatelor obținute în cadrul proiectului (2022-2024)

Evaluarea impactului agenților toxici din mediu implică o abordare sistematică pentru a înțelege distribuția, expunerea, toxicitatea și riscurile potențiale pentru sănătatea umană. În aceste sens, s-a dezvoltat un model de expunere la cadmiu (Cd) și plumb (Pb) pe doua linii celulare normale de colon, după care au fost evaluate modificările la nivel genomic si transcriptomic.

În urma analizei datelor moleculare au fost identificate semnături specifice expunerii la metale, pe fiecare linie celulară în parte. În imaginea de mai jos se poate vizualiza reprezentarea de tip heatmap care indică importante modificări la nivel transcriptomic asociate expunerii la plumb pe o linia celulara de origine epitelială (CCD-18Co).

Abordarea complexă din punct de vedere a biotoxicologiei umane (biomarkeri de expunere), a geneticii/genomicii (de la modele experimentale în expunerea la Pb și Cd,  la analiza genomică a probelor biologice) și nu în ultimul rând la o componentă analitică avansată în evaluarea relației/asocierii între expunere și efectele urmărite, au generat rezultate noi si promițătoare pentru elaborarea unor programe de supraveghere și prevenire și pentru obținerea unor informații necesare în elaborarea de metode/tehnici noi, avansate de tratament.

Evaluarea profilului miRNA folosind tehnica microarray (tehnologia Agilent) în infertilitatea de cauză idiopatică și respectiv, în cazul diagnosticelor de boală inflamatorie pelvină și sindromul de ovar polichistic oferă o înțelegere mai profundă a mecanismelor moleculare implicate în aceste afecțiuni. Analiza alterărilor la nivel de expresie ale acestor miARN-uri și a genelor țintă furnizează informații importante despre modul în care aceste molecule pot afecta anumite mecanisme și procese biologice relevante. Aceste date experimentale sunt extrem de utile oferind oportunități pentru diagnosticul și prognosticul îmbunătățit al afecțiunilor asociate cu expunerea la metale (arsen (As), Pb, Cd). De asemenea, ele deschid calea pentru dezvoltarea de terapii personalizate care să vizeze specific căile moleculare afectate în fiecare afecțiune.